RayBiotech抗体芯片在重度哮喘机制研究的应用
杂志名称：Cellular signalling
文献题目：Salem I H, Plante S, Gounni A S, et al. A shift in the IL-6/STAT3 signalling pathway imbalance towards the SHP2 pathway in severe asthma results in reduced proliferation process[J]. Cellular signalling, 2018, 43: 47-54.
第一作者：Ikhlass Haj Salem
通讯作者：Dr. Jamila Chakir
作者单位：Centre de Recherche, Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec,Université Laval, Québec, Canada
本实验所用产品：Human Cytokine Antibody Array V（AAH-CYT-5）
实验样品：细胞培养上清
研究背景：
持续性支气管炎症和气道重塑是哮喘的特征。由结构细胞和高度特化的细胞外基质（ECM）组成的粘膜微环境在气道重塑和炎症中起作用。支气管成纤维细胞是负责ECM在气道和肺组织中产生和转换的主要结构细胞。在哮喘中，修复过程失调并导致支气管成纤维细胞活化增加，这些成纤维细胞获得肌成纤维细胞表型并增强基底膜下的胶原沉积。位于支气管粘膜中的肌成纤维细胞数量与基底膜增厚相关。已显示亚上皮层和网状基底膜的厚度与哮喘的严重程度相关。成纤维细胞通过产生多种介质并调节局部细胞和细胞因子微环境。在这些介质中，IL-6长期以来被认为是炎症的一般标志物，与哮喘的肺功能受损相关。我们以前报道过来自轻度哮喘患者的支气管成纤维细胞产生高水平的IL-6，T细胞和支气管成纤维细胞之间的相互作用导致这种细胞因子的产生增加。然而，尚未研究轻度和重度哮喘中支气管成纤维细胞中IL-6信号传导的调节。本文旨在研究IL-6信号转到在重度哮喘中的作用。
1 结果
1.1 严重哮喘患者的成纤维细胞产生IL-6
使用RayBio细胞因子抗体芯片进行实验，发现与健康对照相比，来自轻度和重度哮喘患者的成纤维细胞中IL-6释放显着增加（图1A-B）。与用细胞因子阵列获得的数据一致，使用ELISA（图1C）在蛋白质水平证实轻度和重度哮喘患者中IL-6水平的增加，并且通过qPCR在mRNA水平证实（图1D）。与对照受试者相比，来自严重哮喘患者（p = 0.0005）和轻度哮喘患者（p = 0.001）的成纤维细胞中IL-6mRNA表达更高。对于IL-6R基因表达和sIL-6R释放没有观察到显着差异。
1.2 IL-6对STAT3磷酸化的影响
源自轻度与重度哮喘患者（p = 0.05）和对照受试者（p = 0.05）的成纤维细胞中STAT3的基线活化显着更高。 STAT3 Tyr705磷酸化在IL-6刺激，30分钟达到峰值并且在120分钟时下降回到基线水平（p = 0.016）（图2A和2B）。相反，IL-6在源自严重哮喘的成纤维细胞中不诱导STAT3酪氨酸磷酸化。总之，这些结果表明IL-6不会激活严重哮喘中STAT3的酪氨酸磷酸化状态。该结果提出了额外的信号传导机制干扰来自严重哮喘患者的成纤维细胞中IL-6信号传导的可能性。
来自严重哮喘患者的成纤维细胞中的组成型SHP2活化一种被证实的阻止STAT3磷酸化的机制包括其通过SHP2的去磷酸化。因此，研究人员调查了模型中是否存在这种情况。 SHP2的基线酪氨酸磷酸化在源自严重与轻度哮喘患者（Fold = 8.5±2.6; p = 0.0039）和对照受试者（Fold = 6±0.9; p = 0.0002）的成纤维细胞中显着更高（图3A）。 IL-6不会诱导来自严重哮喘患者的成纤维细胞中SHP2酪氨酸磷酸化的进一步增加（图3A和3B）。在三组的成纤维细胞中SHP2的基因和蛋白质表达均未显示差异。此外，高剂量的IL-6未能在源自轻度哮喘患者和健康对照的成纤维细胞中诱导SHP2酪氨酸磷酸化，这表明过量的基线SHP2激活是严重的哮喘特异性。
1.3 SHP2抑制对STAT3磷酸化的影响
为了测试去活化的SHP2是否干扰STAT3活化，我们使用PHPS1特异性药理学抑制剂来靶向来自严重哮喘患者的成纤维细胞中的SHP2活性。与载体处理相比，用PHPS1处理的成纤维细胞显示SHP2磷酸化降低80％（图4-A）。 SHP2的抑制也导致STAT3磷酸化的显着恢复（图4-A-B）。由于SOCS蛋白，特别是SOSC3成员，在STAT3激活后迅速诱导，在IL-6刺激后使用qRT-PCR测定SOCS3基因表达。在来自严重哮喘的成纤维细胞中未观察到IL-6刺激对SOCS3基因表达的影响（图4-C）。然而，用SHP2抑制剂治疗来自严重哮喘患者的成纤维细胞诱导了SOCS3基因表达的显着增加（图4-C）。总之，这些数据表明，在严重哮喘患者的成纤维细胞中激活的SHP2对IL-6诱导的STAT3途径激活发挥负调节作用。
重症哮喘患者的p38 / MAPK活化和成纤维细胞增殖有力支持SHP2参与包含细胞外信号调节激酶（ERK），p38和c-Jun N末端激酶的MAPK通路。接下来研究了这些MAPK途径是否在严重哮喘患者的成纤维细胞中SHP2活化后被激活。如图5-A-B所示，当SHP2被激活时，p38磷酸化在来自严重哮喘患者的成纤维细胞中升高。在用ASHP2抑制剂治疗后，观察到SHP2磷酸化（p <0.01）和p38磷酸化（p = 0.002）的同时降低，而当使用化学抑制剂SB212190抑制p38时，未显示对SHP2活化的影响。相反，SHP2抑制对ERK和c-Jun磷酸化没有影响。这些数据一起表明SHP2是重症哮喘患者成纤维细胞中p38上游的重要信号转导物。由于p38MAPK信号通路在细胞增殖中起重要作用，评估了使用药理学抑制剂对成纤维细胞增殖的p38抑制作用。在基线时，与对照（NBF）相比，来自严重哮喘患者的成纤维细胞（SABF）显示出显着较低的基线增殖率（平均OD为0.42±0.02％）（平均OD为1.05±0.12; p = 0.005）。分别使用化学抑制剂PHPS1（10μM）和SB212190（10μM）的SHP2和p38抑制均增加了来自严重哮喘患者的成纤维细胞的细胞增殖率（PHPS1为p = 0.01，SB212190为p = 0.02）（图5-C））。
结论：
与健康对照相比，来自轻度和重度哮喘患者的成纤维细胞中IL-6释放显着增加。与轻度哮喘患者和健康对照相比，来自严重哮喘患者的成纤维细胞显示出STAT3活化减少。发现磷酸酶SHP2的组成型活化负面调节来自严重哮喘患者的成纤维细胞中IL-6诱导的STAT3磷酸化。由于活化的p38 /丝裂原活化蛋白激酶，这种效应伴随着成纤维细胞增殖速率的降低。 SHP2和p38 / MAPK特异性抑制剂（PHPS1和SB212190）显着诱导STAT3磷酸化，IL-6靶基因表达和细胞增殖的恢复。这些数据显示来自严重嗜酸性粒细胞哮喘受试者的支气管成纤维细胞中IL-6信号传导失调，该受试者涉及蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2和p38MAPK。总的来说，结果为支气管成纤维细胞调节严重哮喘气道重塑的机制提供了新的见解。
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