> 这个“CCL5-HIF1α-ZEB1”信号轴的每一个环节都得到了体内外实验和临床数据的支持，并与患者的不良预后密切相关。这一发现不仅为深入理解肝癌的进展和转移提供了坚实的理论基础，也为开发阻断肝癌转移的新型治疗策略揭示了潜在的药物靶点。
文献标题 ：Cancer associated fibroblast–derived CCL5 promotes hepatocellular carcinoma metastasis through activating HIF1α/ZEB1 axis
杂志名称 ：cell death & disease
影响因子 ：9.68
第一作者 ：Haixu Xu
通讯作者 ： Zhi Yao & Qiong Xu
作者单位 ：Tianjin Medical University
文章所用抗体芯片 ：Human Cytokine Antibody Array ：AAH-CYT-G1000，一次检测120个人的常见细胞因子
文献摘要 ：研究揭示了肝癌（HCC）微环境中的癌症相关成纤维细胞（CAFs）促进癌细胞转移的新机制。研究发现，这些CAFs会大量分泌一种名为CCL5的趋化因子。CCL5作用于肝癌细胞后，能够阻止一种关键蛋白HIF1α的降解，使其在正常氧气下也能保持稳定，进而激活下游的ZEB1基因。ZEB1的激活会诱导上皮间质转化（EMT），这是癌细胞获得迁移和侵袭能力的关键一步，最终导致肝癌的肺部转移。这个新发现的“CCL5-HIF1α-ZEB1”信号通路与患者的不良预后相关，因此靶向这一通路可能为肝癌治疗提供一种全新的治疗策略。
实验结果
一、研究人员成功地从肝癌（HCC）组织中分离并鉴定出了癌症相关成纤维细胞（CAFs）。他们首先通过组织染色发现，与癌旁组织相比，肝癌组织中聚集了更多表达α-SMA（一种活化成纤维细胞的标志物）的细胞。接着，他们从组织中成功分离培养了CAFs和癌旁组织成纤维细胞（PTFs），并通过一系列分子标记物验证了其身份：这些细胞表达成纤维细胞和间充质细胞的标志物（如α-SMA、波形蛋白和CD90等），而不表达上皮或内皮细胞的标志物，证明了培养的细胞纯度高且具有间充质特性。最后，研究还发现，与来自正常组织的成纤维细胞相比，这些从肿瘤中分离出的CAFs具有更强的增殖和迁移能力。
二、研究人员通过一系列体内和体外实验，证明了癌症相关成纤维细胞（CAFs）在促进肝癌（HCC）转移中的关键作用及其机制。在动物实验中，他们发现将CAFs与肝癌细胞共同注射到小鼠体内，虽然对原发肿瘤的大小没有显著影响，但会显著增加肺部转移瘤的数量和大小，并缩短小鼠的存活时间。相比之下，来自正常组织的成纤维细胞（PTFs）则没有这种显著的促转移效果。接着，在体外实验中，研究人员证实CAFs的分泌物能够大大增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力。更重要的是，他们观察到CAFs的分泌物能诱导肝癌细胞发生形态学上的改变，并从分子层面证实了这是一个上皮间质转化（EMT）的过程：即细胞的上皮标志物E-cadherin表达下调，而间质标志物Vimentin、ZEB1以及与侵袭相关的MMP2和MMP9的表达显著上调。该研究表明，癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌某些物质，诱导肝癌细胞发生上皮间质转化（EMT），从而赋予癌细胞更强的运动和侵袭能力，最终促进了其在体内的致命性转移。
三、研究人员为了找出癌症相关成纤维细胞（CAFs）是通过分泌哪种关键因子来促进肝癌（HCC）转移的，对CAFs的分泌物进行了分析。他们通过RayBiotech的细胞因子芯片Human Cytokine Antibody Array C5筛选发现，与正常组织成纤维细胞（PTFs）相比，CAFs分泌了多种趋化因子，其中CCL5的水平是最高、最显著的。这一发现也通过ELISA实验得到了验证。此外，他们在临床肝癌样本中观察到，CCL5的表达水平与CAF的标志物（ACTA2）呈正相关，并且肝癌患者血清中的CCL5水平显著高于肝硬化患者。这些结果共同指向一个结论：CCL5是CAFs分泌的、用以促进肝癌细胞转移的最重要的调节因子之一。
四、研究人员在体外实验中证实，直接添加CCL5能够模拟CAFs的作用，诱导肝癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）。反之，使用CCL5的中和抗体或者其受体（CCR3和CCR5）的抑制剂，则能有效阻断CAFs对癌细胞的促转移作用。为了在活体中提供最终证据，他们进行了关键的动物实验：将无法产生CCL5的CAFs，或将缺乏CCR3/5受体的癌细胞与另一方共注射到小鼠体内。结果明确显示，无论是在信号发出端（CAFs）阻断CCL5，还是在信号接收端（癌细胞）去除其受体，都能显著抑制由CAFs诱导的肺部转移。这些环环相扣的证据最终证实，CAFs正是通过分泌CCL5，并作用于癌细胞上的CCR3和CCR5受体，来驱动肝癌的致命性转移。
五、研究人员为了阐明CCL5促进肝癌转移的具体分子机制，将目光投向了关键的缺氧调节蛋白HIF1α。他们通过一系列实验发现，无论是直接添加CCL5，还是使用癌症相关成纤维细胞（CAFs）的分泌物，都能显著提高肝癌细胞中HIF1α的表达水平，并促使其在细胞核内积聚。关键的证据在于，当使用CCL5的中和抗体或其受体的抑制剂时，这种由CAFs分泌物引起的HIF1α升高效应就被完全阻断了。这一发现在动物模型的肿瘤组织中得到了验证，并且在人类肝癌患者的样本中也观察到CCL5与HIF1α的表达水平呈正相关。这些结果共同表明，CAFs正是通过分泌CCL5，来特异性地上调肝癌细胞中HIF1α的表达，从而启动后续的转移程序。
六、研究通过基因敲除实验，在体外和动物体内都证实了HIF1α是CCL5信号通路的必要下游靶点。当肝癌细胞中的HIF1α被敲除后，即使有CAFs分泌的CCL5存在，癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）能力也受到了显著抑制，并且在动物模型中也无法有效形成肺部转移。这证明了从CAFs发出的促转移信号必须通过癌细胞内的HIF1α才能生效。接着，研究揭示了其具体分子机制。在正常氧气环境下，HIF1α本应被羟基化修饰，然后被pVHL识别并泛素化，最终被降解。然而，研究发现，CCL5能够通过抑制HIF1α的羟基化和泛素化过程，来阻止其被降解，从而使其在正常氧气下也能稳定存在并发挥作用。最后，临床数据也印证了这一通路的重要性：肝癌组织中的HIF1α水平显著高于癌旁组织，且其高表达与患者更差的生存率密切相关。
七、研究通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证实，HIF1α能够直接结合到ZEB1基因的启动子区域，从而在转录层面直接开启其表达。这构成了整个转移信号链的最后一环：当HIF1α被敲除后，癌细胞的转移能力会受到抑制，但如果此时人为地恢复ZEB1的表达，之前被抑制的转移能力又能部分地被重新激活。这证明了ZEB1是HIF1α诱导上皮间质转化（EMT）并促进转移所必需的下游执行因子。这一发现在临床样本中也得到验证，HIF1α和ZEB1的表达水平在肝癌组织中呈正相关。更重要的是，与HIF1α一样，ZEB1在肝癌组织中也显著高表达，并且其高水平与患者更差的生存率、更高的肿瘤分级和分期密切相关。
实验讨论 ：肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞（CAFs）会分泌一种关键的趋化因子CCL5。CCL5与肝癌细胞表面的CCR3和CCR5受体结合后，触发了细胞内的一系列级联反应。其最关键的机制在于，该信号能够抑制关键蛋白HIF1α在正常氧气下的泛素化降解过程，使其得以稳定存在并进入细胞核。随后，稳定的HIF1α会直接作为转录因子，激活下游的ZEB1基因。ZEB1的表达最终驱动了上皮间质转化（EMT），赋予了癌细胞强大的侵袭和转移能力。这个“CCL5-HIF1α-ZEB1”信号轴的每一个环节都得到了体内外实验和临床数据的支持，并与患者的不良预后密切相关。这一发现不仅为深入理解肝癌的进展和转移提供了坚实的理论基础，也为开发阻断肝癌转移的新型治疗策略揭示了潜在的药物靶点。
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