最后审核：2026 年 10 月 18 日
流式细胞术的设门策略（gating strategy），是从仪器记录的全部事件一步步筛到目标细胞群的一套固定顺序。设得好，碎片、粘连体（doublet）和死细胞会在判断任何标志物之前就被去掉，每一条阳性/阴性边界都有对照依据，而不是凭肉眼”感觉”。本文按顺序讲设门层级、每一步需要的对照，以及最常见的设门错误。
要点速览
- 固定顺序：时间门（可选）→ FSC/SSC 细胞门 → 单细胞门 → 活细胞门 → 谱系门 → 亚群。
- 在判断任何标志物之前，用 FSC-A 对 FSC-H 去除粘连体。
- 一定要加活性染料：死细胞会非特异结合抗体，造成假阳性。
- 阳性/阴性边界用 FMO 对照（fluorescence minus one）确定，不用同型对照。
- 补偿用单染对照：同一荧光素（串联染料要同一批号），亮度不低于样本。
- 同一实验所有样本套用同一套门模板，结果以”占上一级门的百分比”报告。
设门层级，一步一步来
- 时间对荧光（可选）：看上样过程有没有堵塞、流速波动，只保留平稳的那一段。
- FSC-A 对 SSC-A，圈细胞去碎片：门画得宽一些，只去掉左下角低 FSC 的碎片。血液中淋巴、单核分群清楚；组织消化样本更杂，宁宽勿窄，后面的门再精修。
- 单细胞门：两个细胞同时通过激光时，脉冲面积（A）变大、高度（H）变化不大。在 FSC-A 对 FSC-H 图上，单细胞落在对角线上，偏离对角线的是粘连体。容易粘连的细胞可再加一道 SSC-A 对 SSC-H。
- 活细胞门：圈活性染料阴性的细胞。需要固定、破膜（如胞内因子染色）时用可固定的胺反应活性染料；PI、7-AAD 只能用于未固定细胞。
- 谱系门：用泛标志物选出母群，例如 CD45 圈白细胞，再用 CD3 圈 T 细胞、CD19 圈 B 细胞。把不需要的谱系放在同一个通道做 dump 通道，可以让这一步更干净。
- 亚群与功能标志物：在谱系门内再分亚群（如 CD4、CD8），然后判断活化、细胞因子、增殖等标志物，每一个都对照各自的 FMO。
- 反向设门（back-gating）：把最终细胞群叠加回前面的散点图、单细胞图、活性图上，看它是否落在预期位置；如果不在，说明前面某道门切掉了目标细胞或放进了杂质。
每道门需要哪些对照？
| 对照 | 回答什么问题 | 用途 |
|---|---|---|
| 未染色细胞 | 细胞本身有多亮？ | 调电压，评估自发荧光 |
| 单染对照（细胞或补偿微球） | 每种染料往其他通道”溢出”多少？ | 计算补偿矩阵 |
| FMO 对照 | 其他染料都在时，阴性群延伸到哪里？ | 确定阳性/阴性边界 |
| 活性染料 | 哪些是死细胞、濒死细胞？ | 排除非特异结合 |
| 生物学对照（未刺激组、已知阳性组） | 变化是不是真实生物学效应？ | 解读活化、细胞因子数据 |
| 同型对照 | 有没有 Fc 介导的背景？ | 检查 Fc 封闭效果，不用于设门 |
为什么用 FMO，不用同型对照设门？
多色实验中，补偿只扣除了平均溢出，扣不掉溢出带来的”展宽”（spreading）。邻近通道的亮染料会让阴性群变宽，所以全染管里真正的阴性范围比未染色管、同型对照管更宽。FMO 对照只少了待判断的那一种抗体，其余全部保留，正好反映该通道阴性群实际延伸到哪里。同型对照与检测抗体在浓度、荧光素标记比例、克隆上都不同，不适合作为门的边界参照。
补偿检查清单
- 每种荧光素一个单染对照，用的就是实验中那支试剂；PE-Cy7、APC-Cy7 等串联染料批间差异大。
- 单染对照中阳性群亮度不低于样本中最亮的细胞。
- 同一对照中阳性和阴性事件自发荧光一致（同种细胞，或都用微球）。
- 对照和样本用同一套电压采集；采集后再改电压，补偿矩阵就作废了。
- 补偿后用两两散点图检查：细胞群应横平竖直，不应”倾斜”。
常见设门错误
| 错误 | 后果 | 改正 |
|---|---|---|
| 不去粘连体 | 出现假双阳性（如 CD4+CD8+、T–B 细胞结合体） | 先做 FSC-A/FSC-H 单细胞门 |
| 不加活性染料 | 死细胞对多个标志物呈”阳性” | 加可固定活性染料 |
| 用同型对照或未染色管设门 | 弱表达标志物的阳性率被高估 | 改用 FMO |
| 对活化细胞 FSC/SSC 门画太窄 | 体积变大的活化母细胞被排除 | 散点门放宽，靠活性门和谱系门精修 |
| 每个样本各画各的门 | 组间引入人为偏差 | 统一模板，仅在有记录的仪器漂移时调整 |
| 终门事件数太少 | 稀有群百分比不稳定 | 增加采集事件数，让稀有群至少有几百个细胞 |
论文中怎么呈现设门策略
用一张图展示完整层级，从第一张散点图到最终细胞群，并给出关键门所用的 FMO。写明抗体克隆号和荧光素、活性染料、采集事件数，以及结果表达方式（占上一级门百分比、占活细胞百分比或绝对计数）。审稿人通常参照 MIFlowCyt（流式实验最低信息标准）。
表型之外：同时测细胞因子
流式告诉你”有哪些细胞”，同一实验的培养上清或血清则能告诉你”它们分泌了什么”。RayBiotech 抗体芯片一次可测几十种细胞因子，RayBiotech ELISA 试剂盒用于单一因子定量；巨噬细胞、T 细胞分型常用的标志物抗体，如 CD86 抗体、CD80 抗体、CD11c / CD206 抗体、NCAM1 (CD56) 抗体，可在 RayBiotech 抗体列表查看。巨噬细胞分型的完整思路见巨噬细胞极化检测：M1/M2 标志物，Th17/Treg 方向见 Treg/Th17 平衡轴检测。
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参考文献
- Cossarizza A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 2021;51(12):2708–3145.
- Maecker HT, Trotter J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 2006;69(9):1037–1042.
- Roederer M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 2001;45(3):194–205.
- Lee JA, et al. MIFlowCyt: the minimum information about a flow cytometry experiment. Cytometry A. 2008;73(10):926–930.
仅供科研使用。