最后审核：2026 年 10 月 18 日
Western blot 条带弱、斑驳、不均匀，很多时候问题不在抗体，而在转膜。本文按实验顺序讲清 PVDF 膜和硝酸纤维素膜（NC 膜）怎么选、0.2 µm 和 0.45 µm 孔径怎么选、PVDF 为什么必须先用甲醇活化，以及大分子、小分子蛋白转膜条件怎么调。
要点速览
- PVDF 膜结合蛋白能力强、机械强度高，适合低丰度靶标和剥离再孵育（stripping/reprobing）；NC 膜背景通常更低，常规检测够用。
- 多数蛋白用 0.45 µm；约 20 kDa 以下的小蛋白和多肽用 0.2 µm，防止穿膜。
- PVDF 必须先在 100% 甲醇中活化 15–30 秒，变均匀半透明后再水洗、转膜液平衡；活化后全程不能干。
- 转膜”三明治”从负极到正极：海绵—滤纸—凝胶—膜—滤纸—海绵，膜在凝胶的正极一侧。
- 大蛋白降甲醇、加少量 SDS、延长时间；小蛋白用 0.2 µm 膜、缩短时间。
- 封闭前用丽春红 S（Ponceau S）检查转膜是否均匀。
PVDF 膜还是 NC 膜？
| 对比项 | PVDF 膜 | NC 膜（硝酸纤维素） |
|---|---|---|
| 蛋白结合 | 疏水结合，结合量更高 | 结合良好，低于 PVDF |
| 预处理 | 必须先甲醇活化 | 直接用转膜液浸湿 |
| 机械强度 | 强，耐剥离再孵育 | 较脆，干燥后易碎 |
| 背景 | 可能偏高，需充分封闭 | 通常较低 |
| 适用 | 低丰度靶标、多次检测同一张膜、N 端测序 | 常规 WB；低荧光型号可做荧光检测 |
孔径：0.2 µm 还是 0.45 µm？
0.45 µm 适合绝大多数蛋白。分子量约 20 kDa 以下的小蛋白、多肽（如部分细胞因子、组蛋白、LC3 等）在转膜电流下容易穿过大孔径膜，建议换 0.2 µm。判断是否穿膜的简单办法：在第一张膜后面再垫一张膜，转完后两张都做丽春红染色，第二张上出现条带说明发生了穿膜。
PVDF 转膜操作步骤
- 活化膜：PVDF 膜按凝胶大小裁好，放入 100% 甲醇 15–30 秒，至整张膜均匀变为半透明；用纯水短暂漂洗，再放入预冷转膜液平衡数分钟。活化后的膜一旦干了，要重新用甲醇活化。
- 平衡凝胶：电泳结束后把凝胶放在转膜液中平衡几分钟，减少转膜中凝胶收缩或溶胀造成的条带变形。
- 装”三明治”：从负极（黑色）到正极（红色）依次为海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵。SDS 包裹的蛋白带负电，向正极移动，所以膜一定在凝胶靠正极的一侧。
- 赶气泡：每铺一层用滚轴或玻璃棒轻轻赶走气泡；任何一个气泡都会在膜上留下空白斑。
- 转膜：湿转（槽式）适用分子量范围最宽、最稳定，常用 Towbin 转膜液（25 mM Tris、192 mM 甘氨酸、20% 甲醇）；半干转和快速转膜系统更省时。湿转要放冰盒或在冷室进行，防止过热。
- 检查转膜：封闭前用丽春红 S 染色，确认条带均匀、无气泡斑；拍照留档，还可作为总蛋白上样参考，之后用 TBST 洗掉即可。
大分子和小分子蛋白怎么调？
| 情况 | 调整方法 | 原因 |
|---|---|---|
| 大蛋白（约 100–150 kDa 以上） | 甲醇降到 10% 或更低；转膜液加少量 SDS（不超过约 0.1%）；用低浓度胶或梯度胶；延长转膜时间 | 甲醇使凝胶孔径收缩，阻碍大蛋白洗脱；SDS 帮助蛋白离开凝胶 |
| 小蛋白（约 20 kDa 以下） | 用 0.2 µm 膜；保持 20% 甲醇；缩短转膜时间 | 防止蛋白穿过膜；甲醇促进蛋白结合到膜上 |
| 同一张胶大小都要 | 湿转、适中时间，必要时把胶按分子量切开分别转 | 兼顾两端 |
常见问题排查
| 现象 | 常见原因 | 处理 |
|---|---|---|
| 膜上有圆形空白斑 | 三明治中有气泡 | 逐层赶气泡，滤纸和海绵充分浸透 |
| PVDF 局部无信号 | 活化不充分或中途变干 | 甲醇活化至整张半透明，转膜前后保持湿润 |
| 大蛋白条带很弱 | 洗脱不完全 | 降甲醇、加少量 SDS、延长时间 |
| 小蛋白消失 | 穿膜 | 换 0.2 µm 膜，缩短时间，垫第二张膜验证 |
| 条带扭曲、发”笑” | 过热或凝胶未平衡 | 冰浴转膜，转膜前平衡凝胶 |
| 背景整体偏高 | 封闭不足、抗体浓度过高 | 延长封闭，重新滴定一抗和二抗 |
转膜之后：抗体与多指标检测
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参考文献
- Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS. 1979;76(9):4350–4354.
- Kurien BT, Scofield RH. Western blotting. Methods. 2006;38(4):283–293.
仅供科研使用。