> 体内CRISPR筛选这一前沿技术在发现肿瘤细胞内在的、能够调控免疫微环境的关键基因方面的巨大威力，为开发新型免疫疗法提供了重要思路。
文献标题 ：In Vivo CRISPR Screens Identify E3 Ligase Cop1 as a Modulator of Macrophage Infiltration and Cancer Immunotherapy Target
杂志名称 ：Cell
影响因子 ：42.5
第一作者 ：Xiaoqing Wang
通讯作者 ：X Shirley Liu
作者单位 ：Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute
文章所用抗体芯片 ：Mouse Cytokine Array C1000 ：AAM-CYT-1000，一次检测96个小鼠的常见细胞因子
文章摘要
实验结果
一、研究人员首先构建了一个名为MusCK的鼠源慢病毒CRISPR-Cas9基因敲除文库，该文库经验证后被导入到小鼠的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系4T1中。随后，这些经过基因编辑的癌细胞被植入到三种不同免疫背景的小鼠体内（免疫缺陷、免疫健全以及经过疫苗接种的免疫健全小鼠）进行生长。通过对比分析不同小鼠体内肿瘤细胞中导向RNA（sgRNA）的丰度变化，研究人员得以筛选出促进癌细胞逃避免疫系统攻击的基因。研究发现，除了已知的免疫抑制基因如Cd274 (PD-L1)和一些DNA修复通路的关键基因外，干扰素γ（IFNγ）信号通路中的关键基因（如Jak1, Jak2, Stat1）的缺失反而会增强免疫系统对肿瘤的杀伤作用。这一结果与先前在其他肿瘤模型中的发现有所不同，但与IFNγ在某些癌症中促进免疫逃逸的作用一致。研究人员推测，肿瘤微环境中持续的IFNγ信号可能具有免疫抑制功能。最后，通过竞争性实验，他们进一步证实了在TNBC细胞中敲除Jak1或Stat1会削弱其在免疫健全小鼠体内的生长优势，从而验证了IFNγ信号通路在肿瘤免疫逃逸中扮演了重要角色。
二、研究人员为了进一步验证并提高体内CRISPR筛选的可靠性，构建了一个优化的基因文库（MusCK 2.0），并进行了第二轮筛选。他们将经过基因编辑的癌细胞植入到四组不同免疫背景的小鼠中，其中包括一组同时接受了抗PD-1免疫治疗的小鼠。结果再次验证了之前的发现，即敲除免疫逃逸相关基因（如PD-L1）和干扰素γ（IFNγ）信号通路基因会抑制肿瘤生长。在两轮筛选中，一个名为Cop1的E3泛素连接酶基因，在免疫健全小鼠体内的肿瘤中始终是缺失最显著的基因。进一步的实验证实，在体外培养时，敲除Cop1对癌细胞的生存没有影响；但在小鼠体内，敲除Cop1能显著减缓三阴性乳腺癌（TNBC）和结直肠癌肿瘤的生长，并延长小鼠的存活时间。尤其值得注意的是，在结直肠癌模型中，敲除Cop1基因再结合抗PD-1免疫疗法，能够完全清除肿瘤，使小鼠存活率达到100%。这表明，抑制Cop1的功能不仅能增强抗肿瘤免疫反应，还可能作为一种有效的策略来提高癌症免疫疗法的效果，且这种机制可能适用于多种类型的癌症。
三、研究人员通过基因表达分析（RNA-seq）发现，在三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中敲除Cop1基因，会显著下调一系列与免疫相关的通路，特别是那些负责招募和激活巨噬细胞的多种细胞因子和趋化因子（如Ccl2, Ccl5等）。这一分子层面的变化直接导致了在小鼠体内的Cop1基因敲除肿瘤中，巨噬细胞的浸润数量显著减少，而其他免疫细胞（如CD8+ T细胞）的数量则没有明显变化。更精细的单细胞测序分析进一步揭示，Cop1的缺失不仅减少了巨噬细胞的总量，还改变了其内部组成：促肿瘤的M2型巨噬细胞减少，而抗肿瘤的M1型巨噬细胞增多。综合来看，在肿瘤细胞中，Cop1通过调控多种趋化因子的分泌来促进巨噬细胞向肿瘤微环境的聚集。因此，抑制Cop1的功能可以有效减少肿瘤内的巨噬细胞浸润，特别是抑制了那些帮助肿瘤生长的M2型巨噬细胞，从而减缓了肿瘤的进展。
四、为了找出E3泛素连接酶Cop1在细胞内降解的具体蛋白质底物，研究人员综合运用了多种高通量分析方法。首先，他们通过对基因表达数据（RNA-seq）的计算分析和对染色质开放性（ATAC-seq）的检测，初步锁定AP-1和CEBP这两个转录因子家族是潜在的调控者。接着，利用蛋白质组学（质谱分析）技术直接检测蛋白质水平的变化，并结合蛋白酶体抑制剂处理，他们最终确定了CEBP家族中的C/ebpδ是Cop1的一个特异性底物。最关键的是，在一项“拯救”实验中，他们发现同时敲除Cop1和C/ebpδ，可以完全逆转单独敲除Cop1所带来的肿瘤生长抑制效果。这一系列证据有力地证明了，在肿瘤细胞中，C/ebpδ是Cop1的关键下游靶点。当Cop1功能丧失时，C/ebpδ会因无法被降解而积累起来，正是这种积累最终导致了肿瘤生长的减缓。
五、通过分子生物学实验（ChIP-seq），研究人员证实当Cop1基因被敲除后，其底物C/ebpδ蛋白会因无法被降解而大量积累。这些积累的C/ebpδ会结合到DNA上，并扮演转录抑制因子的角色，专门抑制一系列负责吸引巨噬细胞的关键趋化因子基因（如Ccl2和Ccl7）的表达。反向实验也证明，敲除C/ebpδ本身会使这些趋化因子的表达量上升。其次，为了验证这一机制在人类癌症中的临床相关性，研究人员分析了公共肿瘤数据库（TCGA）。分析结果显示，在多种人类癌症中，COP1的高表达与促肿瘤的M2型巨噬细胞浸润显著正相关，而CEBPD（C/ebpδ的人类同源基因）的表达则与之负相关。更重要的是，在多种癌症中，低的COP1表达水平与患者更好的生存预后相关。这些结果揭示了一个完整的调控链：Cop1通过降解C/ebpδ来维持巨噬细胞趋化因子的表达，而C/ebpδ则是一个抑制这些趋化因子的“刹-车”；这一机制在人类癌症中同样存在，并与肿瘤的免疫微环境和病人的生存率密切相关。
六、研究人员首先通过生物信息学预测发现，C/ebpδ本身可能不是Cop1的直接底物，这表明可能存在一个中间“桥梁”蛋白。通过一系列实验，他们最终锁定并证实了一个名为Trib2的蛋白正是这个关键的“桥梁”或“衔接蛋白”。实验证据表明：在细胞内，Cop1、Trib2和C/ebpδ这三个蛋白能够相互结合，形成一个复合物。敲除Cop1会导致Trib2和C/ebpδ的蛋白水平都显著升高，而它们的信使RNA（mRNA）水平不变，证明Cop1是在蛋白质层面调控它们的降解。通过使用蛋白酶体抑制剂，研究证实了Cop1是通过蛋白酶体途径来降解C/ebpδ的。当研究人员敲除“桥梁”蛋白Trib2后，Cop1与C/ebpδ之间的相互作用被破坏，导致C/ebpδ蛋白无法被降解而积累起来。该研究揭示了一个精确的调控模型：在癌细胞中，Cop1并非直接作用于C/ebpδ，而是通过与衔接蛋白Trib2结合，再由Trib2招募C/ebpδ，从而将C/ebpδ标记上泛素并引导其被蛋白酶体降解。这个机制的阐明，为理解如何通过抑制Cop1来稳定C/ebpδ、进而增强肿瘤免疫治疗效果提供了清晰的分子基础。
文章讨论 ：该研究通过大规模CRISPR基因筛选，发现了一个全新的调控肿瘤免疫微环境的信号通路：Cop1-Trib2-C/ebpδ轴。具体来说，在三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中，E3泛素连接酶Cop1会通过一个名为Trib2的衔接蛋白，来降解转录因子C/ebpδ。而C/ebpδ本身的功能是抑制癌细胞释放吸引巨噬细胞的趋化因子。因此，抑制Cop1的功能会导致C/ebpδ蛋白稳定积累，进而减少肿瘤内巨噬细胞的浸润，最终使肿瘤对PD-1免疫疗法更敏感，并提高小鼠模型的存活率。这一机制在多种人类癌症的临床数据中也得到了印证。研究意外发现，在乳腺癌中抑制IFNγ信号通路的关键基因（如Jak1, Stat1）反而能增强免疫治疗效果。这挑战了传统上认为IFNγ信号总是促进抗肿瘤免疫的观点，并提出其作用可能依赖于肿瘤类型、信号强度和持续时间。尽管Cop1在体外对癌细胞生长影响不大，但它在体内主要通过重塑肿瘤免疫微环境（特别是调控巨噬细胞）来促进肿瘤进展。这使其成为一个极具潜力的免疫治疗新靶点。Cop1调控的细胞因子可能还影响除巨噬细胞外的其他免疫细胞。同时，Cop1在免疫细胞和正常组织中也有表达，因此未来开发Cop1抑制剂时需考虑其全身性影响。此外，AP-1等其他转录因子家族可能也参与其中，需要进一步研究。该研究彰显了体内CRISPR筛选这一前沿技术在发现肿瘤细胞内在的、能够调控免疫微环境的关键基因方面的巨大威力，为开发新型免疫疗法提供了重要思路。 信号通路研究专题
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