文献标题 ：Mutant p53 exploits enhancers to elevate immunosuppressive chemokine expression and impair immune checkpoint inhibitors in pancreatic cancer
杂志 ：Immunity
影响因子 ：33.2
第一作者 ：Dig B. Mahat
通讯作者 ： Rakesh K. Jain，Phillip A. Sharp
作者单位 ：Massachusetts Institute of Technology，MIT
文献所用芯片 ：[Mouse Cytokine Array C3：AAM-CYT-3](https://www.raybiotech.com/mouse-cytokine-array-c3-aam-cyt-3)，一次筛选检测62个关键的小鼠细胞因子靶标
文献介绍 ：胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命癌症，目前治疗效果有限，免疫检查点抑制剂（ICIs）对其无效。本文旨在探讨致癌基因KRAS和肿瘤抑制基因TP53的突变如何影响PDAC的免疫微环境，特别是突变p53如何通过改变基因程序，促进免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的形成。研究人员利用基因工程小鼠模型和多种分子生物学技术，深入分析了p53R172H突变在PDAC中的作用，以期为开发新的治疗策略提供线索。
实验结果 一、通过使用KPC细胞和CRISPR-Cas9技术构建的同基因细胞系，研究发现p53R172H主要上调趋化因子和NF-κB通路的基因表达，同时抑制与细胞增殖相关的生物合成和代谢基因。实验进一步证实，p53R172H能够特异性驱动CCL和ELR + CXCL趋化因子亚类的表达，尤其显著增加Cxcl1、Cxcl5和Ccl2的自分泌水平。这些发现揭示了p53R172H获得了新的转录调控功能，从而影响趋化因子表达，这对于理解PDAC的免疫微环境及开发靶向治疗策略具有重要意义。
二、通过将携带p53R172H突变的细胞或p53缺失的细胞原位植入免疫功能正常的荷瘤小鼠体内，研究发现p53R172H突变的存在显著促进了PDAC的生长，并营造出免疫抑制性的肿瘤微环境（TME），表现为T细胞（包括活化的CD8+T细胞和细胞毒性T细胞）浸润减少，而髓源性抑制细胞（MDSCs）浸润增加。更重要的是，相比于p53R172H突变型肿瘤，p53缺失型肿瘤对ICIs治疗表现出极高的敏感性，显著提高了小鼠的存活率，部分小鼠肿瘤完全消退并建立了免疫记忆。这些结果表明p53R172H在PDAC中诱导免疫抑制并促进肿瘤免疫逃逸，从而影响ICIs的疗效。
三、研究团队首先评估了Ccl2在肿瘤生长和对ICIs反应中的作用，但发现其缺失并未对肿瘤生长或ICI敏感性产生显著影响。随后，研究转向其他p53R172H依赖性趋化因子，发现单独敲除Cxcl1能显著抑制肿瘤生长，其效果与p53R172H缺失相似，并且导致T细胞浸润增加、髓源性抑制细胞（MDSCs）和中性粒细胞减少，以及先天淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等抗肿瘤免疫细胞的浸润增加。这些免疫微环境的改变使得Cxcl1缺失型肿瘤对ICIs治疗的敏感性提高，显著延长了荷瘤小鼠的生存期。因此，本研究表明Cxcl1是p53R172H致癌作用的关键介质，通过构建免疫抑制性TME来促进肿瘤生长并降低ICIs疗效。
四、研究发现，p53R172H特异性结合到Cxcl1基因的启动子和上游增强子区域，这些区域富含转录共激活因子p300和组蛋白修饰H3K27Ac，并表现出活跃的增强子RNA（eRNA）转录，表明它们是活跃的转录增强子。通过PRO-seq（精确核延伸测序）技术，研究人员识别出Cxcl1附近的三个活跃增强子，并证实p53R172H的结合显著增强了这些增强子的转录活性，从而上调了Cxcl1及其他趋化因子的新生RNA转录。进一步分析表明，p53R172H并非直接打开染色质，而是增强了已开放染色质区域的转录激活潜力。与野生型p53（p53WT）的基因组结合模式对比，本研究证实p53R172H对Cxcl1增强子的结合是其获得的新的功能，而非p53WT残余活性，揭示了p53R172H通过直接调控Cxcl1表达来促进免疫抑制性TME的关键机制。
五、研究人员利用CRISPR-Cas9技术系统性地删除了Cxcl1基因附近的三个增强子（e8695、e8696和e8697），发现e8695和e8696的缺失显著降低了Cxcl1的表达，并明显抑制了肿瘤生长，其效果与Cxcl1基因本身的缺失相似。免疫分析显示，缺失e8695和e8696的肿瘤微环境（TME）中T细胞浸润增加，而髓源性抑制细胞（MDSCs）和中性粒细胞减少，同时先天淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等抗肿瘤免疫细胞数量增多，呈现出更强的抗肿瘤免疫活性。进一步的体内实验证实，e8696缺失型肿瘤对免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗反应良好，显著提高了小鼠的存活率。这些结果表明，p53R172H所结合的Cxcl1上游增强子（e8695和e8696）是调控Cxcl1表达和p53R172H介导PDAC免疫抑制的关键因素。
六、分析发现，p53R172H的DNA结合并不依赖于经典的p53结合基序，而是在其结合位点富集了NF-κB基序，提示p53R172H可能与NF-κB协同作用。CUT&RUN实验证实，NF-κB的RelA（p65）亚基确实结合于Cxcl1的启动子和增强子区域，并且在p53R172H存在时，NF-κB的染色质结合和磷酸化水平适度增加，核转位也随之增加，这表明p53R172H可能通过影响NF-κB的活性来调控下游基因。尽管p53R172H使NF-κB结合增加了20%-25%，但这不足以完全解释Cxcl1表达的4倍上调，提示可能存在其他调控机制。此外，研究还发现p53R172H和NF-κB的基因组结合位点存在显著重叠，主要集中在启动子和增强子区域，且新生RNA转录水平与p53R172H的结合更为相关，表明新生转录是预测启动子和增强子转录状态更准确的指标。这些结果揭示了NF-κB在很大程度上独立于p53R172H结合到Cxcl1的调控区域，但p53R172H通过调节NF-κB的活性协同增强了Cxcl1的表达。
七、实验结果显示，IKKβ抑制剂TPCA-1能显著降低NF-κB和p53R172H在Cxcl1增强子上的结合，表明p53R172H的结合高度依赖于NF-κB通路。对TCGA PDAC数据集的分析揭示，p53R172H上调基因高表达的患者预后显著更差，且TP53 DNA结合域（DBD）突变患者倾向于比TP53无效突变患者预后更差，并伴有活化NF-κB（磷酸化p65）水平升高。此外，小鼠Cxcl1增强子在人类基因组中存在同源区域，位于CXCL2基因上游，且这些区域也富含NF-κB结合基序。结肠癌细胞中的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据显示，突变p53（p53R273H）与NF-κB在TNF-α刺激下共同占据这些同源增强子区域，而野生型p53则不结合。这些发现共同证实，p53R172H通过依赖NF-κB结合到Cxcl1增强子，调控Cxcl1表达，进而促进PDAC的免疫抑制性肿瘤微环境，并对人类PDAC的预后产生负面影响。
文献讨论：本研究揭示了p53R172H突变型蛋白通过调控癌细胞特异性基因表达程序，塑造免疫抑制性肿瘤微环境（TME），从而促进胰腺导管腺癌（PDAC）生长并降低免疫检查点抑制剂（ICIs）疗效的关键机制。具体而言，p53R172H结合于Cxcl1基因的远端增强子，并以NF-κB依赖的方式增强其表达，导致T细胞浸润减少、髓源性抑制细胞（MDSCs）增加。这一发现不仅阐明了p53R172H介导免疫抑制的分子机制，还强调了增强子在疾病发生发展中的重要性及其作为潜在治疗靶点的价值。鉴于Cxcl1高表达与不良预后相关，以及NF-κB通路的广泛激活，靶向Cxcl1增强子为PDAC治疗提供了一种降低毒性、提高疗效的新策略。同时，本研究也为理解突变转录因子如何通过与增强子相互作用驱动癌症异常基因程序，以及解释ICIs在特定癌症中疗效不佳提供了重要的机制性线索，与临床数据高度吻合。
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