ELISA 计算是 ELISA 实验的最后一步，也是最关键的一步。选对标准曲线的拟合方法，才能更准确地得到样本浓度。本文以 RayBiotech 人 VEGF ELISA 试剂盒（货号 ELH-VEGF-1）的实测数据为例，一步步演示四参数法和 log-log 法的计算过程。
ELISA 常用的三种计算模型
- 四参数 logistic 曲线拟合：多数情况下应用最广的模型，标准曲线为 y = min + (max − min) / (1 + (x/EC50)^(−Hillslope))。
- Log-log 拟合：原本用于免疫学检测，同样适用于 ELISA，常用于计算竞争法 ELISA 的浓度，方程为 lg(y) = a·lg(x) + b。
- 直线回归：最简单的模型，把所有测试点拟合成一条直线，可直接在 Excel 中计算作图，方程为 y = a + bx。
该如何挑选计算方法？
要根据 ELISA 平台的原理、待测靶标的浓度范围和实测 OD 值来选择拟合模型，并综合标准曲线的走势和相关系数 R 值，最终确定适合自己的回归方程。下面介绍应用最广的四参数法和 log-log 法的具体步骤。
一、四参数法计算步骤
1. 获得实验数据
- 检测样本：细胞上清（2 倍稀释）
- 检测靶标：人 VEGF，RayBiotech 试剂盒货号 ELH-VEGF-1（可检测血清、血浆、细胞裂解液、组织裂解液、细胞上清等）
- 检测灵敏度：10 pg/mL；检测区间：10–6000 pg/mL
- 使用软件：SigmaPlot
2. 数据前处理
注：本次实验未做复孔；如果做了复孔，先计算复孔平均值。
① 按试剂盒说明书的标准品稀释方案进行实验，把梯度标准品浓度、OD 值和样本 OD 值按下图在 Excel 中排好：
② 打开 SigmaPlot，新建 blank notebook：
③ 把数据按下图粘贴到表格中：
3. 数据计算
① 点击菜单栏 ToolBox，选择 Standard Curves Analysis：
② 按下图设置相关参数：
4. 数据读取
① 标准曲线：
② 标准曲线方程及相关系数：
③ 读取样本浓度：
④ 把计算出的浓度乘以稀释倍数，得到样本的实际浓度。
四参数拟合算不出低值怎么办？
如果 SigmaPlot 四参数拟合的标准曲线无法计算出接近背景（background）的低值，可以改用 log-log 法拟合标准曲线来计算浓度。
建议：正式实验前先抽取部分样本做预实验，确定稀释倍数，让样本 OD 值落在四参数曲线的中段，避免 OD 值整体偏大或偏小影响浓度准确性。
二、log-log 法计算步骤
1. 获得实验数据
样本、靶标、试剂盒与上例相同（细胞上清 2 倍稀释，ELH-VEGF-1），使用软件为 Excel。
2. 数据前处理
注：本次实验未做复孔；如果做了复孔，先计算复孔平均值。
① 打开带公式的 log-log 计算 Excel 表格，输入样本数据和 STD0（表格含公式，粘贴数据时请选择“只粘贴数值”）：
② 粘贴标准品 OD 值和对应浓度。表格支持 4–8 个标准品，标准品数量减少时也能使用：
③ 保存表格，开始运算。
3. 数据读取
① 根据标准品数量找到对应的表格，读取标准曲线方程，向下查看样本浓度：
② 把计算出的浓度乘以稀释倍数，得到样本的实际浓度。
R² 不到 0.9 怎么办？
案例中多数样本 OD 值很低。用 log-log 法计算时，如果高浓度标准品影响了整体曲线的线性，可以去掉几个高浓度标准品，再用剩下的点建立方程计算结果。下面分别是 5 个标准品和 4 个标准品的拟合效果：
5 个标准品的标准曲线：
4 个标准品的标准曲线：
关于 RayBiotech ELISA 试剂盒
RayBiotech ELISA 试剂盒为美国原装进口，覆盖近 7000 种靶标，可用于血浆、血清、细胞培养上清、裂解物及各类体液中细胞因子、生长因子、受体等蛋白的定量检测。常誉生物为 RayBiotech 国内经销商，可提供选型、报价和实验数据计算方面的咨询。
如需 log-log 计算表格或计算方面的帮助，欢迎在线询价/咨询，或拨打 400-630-6163。
作者：RayBio资讯｜来源：RayBio资讯公众号，常誉生物转载。